Luz

Jun 01, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 502 (2023) Citar este artículo

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La microscopía de fluorescencia de hoja de luz ha transformado nuestra capacidad para visualizar y medir cuantitativamente los procesos biológicos rápidamente y durante largos períodos de tiempo. En esta revisión, discutimos los desarrollos actuales y futuros en microscopía de fluorescencia de hoja de luz que esperamos amplíen aún más sus capacidades. Esto incluye esquemas de imágenes inteligentes y adaptables para superar las compensaciones de imágenes tradicionales, es decir, resolución espaciotemporal, campo de visión y estado de la muestra. En microscopía inteligente, un microscopio decidirá de forma autónoma dónde, cuándo, qué y cómo tomar imágenes. Además, evaluamos cómo las técnicas de restauración de imágenes brindan vías para superar estas compensaciones y cómo los microscopios de hoja de luz "abiertos" pueden permitir imágenes multimodales con alto rendimiento. Como tal, predecimos que la microscopía de hoja de luz cumplirá un papel importante en la obtención de imágenes clínicas y biomédicas en el futuro.

Durante las últimas décadas, los microscopios nos han brindado información invaluable sobre cómo se organizan los procesos biológicos en el espacio y el tiempo. Una innovación central ha sido el etiquetado selectivo de proteínas y lípidos con marcadores fluorescentes1,2, lo que permite técnicas de microscopía fluorescente como la microscopía de fluorescencia de hoja de luz (o microscopía de hoja de luz para abreviar)3. La microscopía de hoja de luz nos permite visualizar, cuantificar y realizar un seguimiento dinámico de los componentes estructurales in vivo4,5,6 e in vitro7,8,9. Los fundamentos de la microscopía de hoja de luz se cubren en varias revisiones10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, pero en resumen, se basa en una separación ortogonal de la ruta de iluminación y detección, lo que permite una selección selectiva. iluminación de un plano de imagen completo y detección simultánea de campo amplio (Fig. 1a).

a La microscopía de hoja de luz tradicional, como la microscopía de iluminación de plano selectivo (SPIM) de tres objetivos, se basa en una disposición ortogonal de la iluminación (azul; objetivos de iluminación IL1 e IL2) y la detección (verde; objetivo de detección DO). Esto garantiza que la resolución axial de las imágenes se rija principalmente por el grosor de la hoja de luz (azul), lo que permite obtener imágenes de muestras grandes con detección de campo amplio (verde) y un buen corte óptico. Para adquirir un volumen 3D, la muestra se escanea a lo largo del eje de detección, ya sea moviendo la muestra o escaneando la hoja de luz junto con el objetivo en la ruta de detección. b–d Los principales ejemplos de imágenes con láminas de luz incluyen imágenes continuas a largo plazo de procesos de desarrollo en embriones de ratón y pez cebra, e imágenes de tejido aclarado con resolución subcelular. b Katie McDole et al.4 caracterizaron los movimientos celulares involucrados en el desarrollo del ratón desde la racha temprana (E6.5) hasta las etapas de somita (E8.5) al obtener imágenes de un embrión de ratón que expresa CAGTAG1 con un marcador de histona (H2B-eGFP) durante más de 44 H. Barra de escala: 100 μm. c Proyecciones seleccionadas de imágenes multivista5 (tres ángulos) de la vasculatura del pez cebra embrionario en crecimiento marcadas con el marcador vascular fluorescente (Tg(kdrl:EGFP), cian) y el marcador de glóbulos rojos (Tg(GATA1a:dsRed), magenta) , fotografiado desde 20 h después de la fertilización (hpf) hasta 86 hpf. Barra de escala: 500 μm d Adam Glaser et al.37 obtuvieron imágenes a gran escala de un corte expandido de riñón de 3,2 cm × 2,1 cm de tamaño y 1 mm de espesor. Las regiones de interés de alta resolución revelaron la morfología de los glomérulos (barra de escala: 40 μm), vasos (barra de escala: 80 μm) y túbulos (barra de escala: 50 μm). El aumento de la resolución debido a la expansión se demostró aún más con un zoom multicanal de tejido contrateñido con DAPI (barras de escala: 100 μm [arriba] y 20 μm [abajo]). Las barras de escala indican las dimensiones del tejido nativo no expandido. El panel b fue adaptado con permiso de Katie McDole et al. (2018)4. Panel c adaptado de Daetwyler et al. (2019)5. Panel d adaptado de Glaser et al. (2019)37.

En esta revisión, miraremos hacia el futuro y discutiremos posibles vías futuras de imágenes de fluorescencia con hojas de luz. Describiremos cómo las barreras de imágenes volumétricas y temporales limitan la aplicación de microscopía óptica para capturar muestras grandes con alta resolución espaciotemporal y explorar estrategias para superarlas. Esto incluye avances en tecnología, nuevos esquemas de imágenes inteligentes y adaptables y técnicas de restauración de imágenes. Además, revisaremos cómo estos esquemas irán de la mano con microscopios de hoja de luz flexibles y abiertos para permitir imágenes multimodales con alto rendimiento.

La microscopía de hoja de luz se destaca por su capacidad de generación de imágenes en 3D eficiente y suave. Se caracteriza por una distribución de la intensidad de la luz en forma de lámina, que ilumina el plano focal de un sistema de detección microscópico (Fig. 1a)3,16. Esto proporciona muchas ventajas. Lo que es más importante, solo (o al menos predominantemente) se ilumina el plano focal del sistema de detección, lo que da como resultado un corte óptico y una mínima excitación fuera de foco15,16,19. Esto conduce a imágenes nítidas sin borrosidad y a una reducción masiva del blanqueo de la muestra en comparación con las técnicas convencionales de microscopía epifluorescente, como la de campo amplio o la confocal10,20.

La excitación del plano focal se logra tradicionalmente con uno o dos objetivos de iluminación para lanzar la(s) hoja(s) de luz3,21. Por lo tanto, la luz láser coherente se transforma en Gaussian3, top hat21, Bessel22,23 simple o múltiple, Airy24 u otro haz25,26 para crear una distribución de intensidad en la muestra que se aproxima a una hoja en una distancia finita. Las imágenes volumétricas se logran escaneando la muestra3, aumentando la profundidad de enfoque27 o moviendo la hoja y la detección28,29.

La detección de los fluoróforos excitados se logra capturando la señal de fluorescencia del plano iluminado con detección de campo amplio en una cámara científica16. Para comprender el beneficio de la microscopía de hoja de luz, el concepto de ciclo de trabajo espacial es importante. Describe cuánto tiempo está encendido un fluoróforo durante la duración de una exposición. Como todo el plano está iluminado, el ciclo de trabajo espacial es mucho más alto con la microscopía de hoja de luz en comparación con los microscopios confocales de escaneo de puntos convencionales, donde solo se escanea una fracción del volumen a la vez. En consecuencia, se pueden aplicar potencias de láser más bajas para producir una señal similar. Esto es importante ya que muchos efectos de fotoblanqueo y fototóxicos son altamente no lineales a la intensidad de excitación10,20. Sin embargo, la detección de campo amplio limita la profundidad de penetración óptica de los microscopios de lámina de luz, ya que la dispersión ocluye imágenes más profundas en los tejidos. Sin embargo, para organoides pequeños y organismos modelo, se puede aplicar la microscopía de hoja de luz, especialmente cuando se combina con la fusión de imágenes30, que combina información de diferentes orientaciones de la muestra. De este modo, las áreas que de otro modo quedarían ocluidas por la dispersión se pueden visitar desde su ángulo de visión más favorable15,31,32. Se pueden adquirir múltiples vistas mediante la rotación de la muestra o, en implementaciones recientes, hasta cuatro objetivos proporcionan caminos ópticos para alternar entre la iluminación de la hoja de luz y la detección33,34,35.

Estas capacidades han permitido que los microscopios de lámina de luz adquieran suavemente datos 3D en cientos o miles de pilas por muestra. Los datos resultantes revelaron y permitieron la cuantificación de procesos dinámicos como la señalización subcelular y la morfología23,25, la embriogénesis durante días4,5,36 (Fig. 1b, c) y proporcionaron una adquisición rápida de grandes tejidos aclarados con resolución subcelular37,38,39 ,40 (Fig. 1d).

A pesar de las imágenes volumétricas rápidas y suaves proporcionadas por la hoja de luz y otros microscopios de fluorescencia16, en última instancia, están limitados por las barreras de imágenes volumétricas y temporales (Fig. 2). Mientras que el primero se refiere a nuestra incapacidad para obtener imágenes de especímenes grandes con alta resolución, el segundo se refiere a nuestra incapacidad para obtener imágenes de procesos muy rápidos de forma continua durante períodos de tiempo prolongados.

a Las técnicas de imagen actuales, como la microscopía de hoja de luz, confocal y de superresolución, tienen un volumen limitado que pueden representar debido a limitaciones técnicas y prácticas (gradiente azul: de baja a alta resolución espacial; los círculos discontinuos blancos indican los regímenes de aplicación predominantes de las tres técnicas de microscopía). Para superar esta barrera de imágenes volumétricas, la microscopía de expansión permite que las técnicas de imágenes de menor resolución adquieran con una resolución efectivamente más alta. Además, esperamos nuevas técnicas de imagen inteligentes y adaptables y la imagen de resolución múltiple para superar la barrera de la imagen volumétrica mediante la imagen selectiva de partes de un gran volumen con alta resolución. Además, los algoritmos de reconstrucción de imágenes, como la detección comprimida y los enfoques de aprendizaje profundo, proporcionarán vías para obtener imágenes de alta resolución a partir de grandes volúmenes parcialmente muestreados. procesos de forma selectiva durante largos periodos de tiempo.

La barrera de imágenes volumétricas (Fig. 2a) está dada por el alcance volumétrico máximo de una tecnología de imágenes dada. Por ejemplo, los especímenes grandes, como un ratón completo, actualmente no se pueden visualizar en su totalidad con imágenes confocales o de superresolución. Esto se rige en parte por limitaciones físicas, como la penetración óptica debido a la dispersión de la luz y la ingeniería óptica, por ejemplo, un equilibrio entre la apertura numérica y la distancia de trabajo, así como el campo de visión41.

Además, el muestreo de Nyquist adecuado puede convertirse en una limitación de la velocidad, por lo que la obtención de imágenes de una muestra grande a alta resolución no es práctica. Para ilustrar esto, un tiempo de permanencia de vóxel común para un microscopio confocal de barrido láser convencional con una resolución de 250 nm es de ~1 μs42 y, por lo tanto, se necesitarían ~4,2 s para capturar una imagen confocal de 2048 × 2048 × 1. Duplicar la resolución con un microscopio Airyscan a 120 nm43 requeriría para el mismo campo de visión ~16,8 s. La obtención de imágenes de un huevo de Drosophila44 de tamaño 9 × 10−3 mm3 (0,18 mm de ancho, 0,51 mm de largo) usando un microscopio confocal con muestreo de Nyquist tomaría 76 min, o más de 10 h con un Airyscan confocal. Esto evita la obtención de imágenes a velocidades que permiten estudios de la dinámica celular, como los procesos de endocitosis que se producen en un minuto45. Si bien la microscopía de hoja de luz es mucho más rápida debido a su adquisición de campo amplio y su alto ciclo de trabajo, las versiones de alta resolución como la microscopía de hoja de luz Lattice23,46 o la microscopía de hoja de luz de barrido axial (ASLM)47 aún pueden tener dificultades para adquirir grandes volúmenes. suficientemente rápido.

Del mismo modo, existe una barrera de imagen temporal (Fig. 2b). Actualmente no podemos generar imágenes de procesos rápidos durante largos períodos de tiempo debido a la cantidad de datos generados y el impacto en la salud de la muestra y el blanqueo de los fluoróforos. Por ejemplo, tomar una imagen de 2048 × 2048 × 1 vóxeles cada 1 ms durante el período de un día equivale a un conjunto de datos de casi 700 TB. Si bien es posible que los problemas de datos se resuelvan en el futuro con nuevo hardware y almacenamientos más grandes, las imágenes continuas inducen efectos fototóxicos, que se acumulan a lo largo de los ciclos de imágenes20,48.

En consecuencia, las adquisiciones tradicionales regidas por el muestreo de Nyquist están limitadas por las compensaciones entre la salud de la muestra, la resolución temporal, la resolución espacial y el campo de visión o la cobertura volumétrica, respectivamente (Fig. 3a). Para tener en cuenta estas compensaciones, un microscopista tiene que elegir una modalidad de imagen que se adapte mejor a la pregunta biológica en cuestión y realizar un experimento con la configuración elegida hasta el final (Fig. 3b).

a Tradicionalmente, una adquisición se rige por un presupuesto de fotones limitado de la muestra. Por lo tanto, la resolución espacial y temporal mejorada suele ser antagónica a la salud de la muestra y al campo de visión que se muestra. Por lo tanto, optimizar una esquina de la pirámide conduce a compensaciones hacia otras esquinas. b En consecuencia, en una adquisición tradicional, se elige un microscopio y/o una configuración de microscopio para reflejar mejor las necesidades de imagen definidas por las preguntas biológicas formuladas: la mejor salud de la muestra, p. , por ejemplo, para estudiar la señalización molecular (bloque de construcción azul), el campo de visión más grande para, por ejemplo, capturar un organismo u órgano completo, como todo el cerebro (bloque de construcción naranja), o la resolución temporal más alta para capturar procesos rápidos como señalización neuronal o movimientos de organismos (bloque de construcción amarillo). c En el futuro, anticipamos que los nuevos esquemas de imágenes inteligentes y adaptativos superarán la limitación actual al proporcionar imágenes modulares dentro de un experimento. Por lo tanto, un microscopio podrá usar detecciones basadas en eventos para cambiar automáticamente entre los modos de imagen, que optimizan, por ejemplo, un gran campo de visión (bloque de construcción naranja), resolución espacial (bloque de construcción azul) y temporal (bloques de construcción amarillo) y ejemplo de salud (bloques de construcción verdes). d En una implementación reciente de un esquema de imagen novedoso de este tipo, Mahecic et al.96 utilizaron redes neuronales para detecciones basadas en eventos. Aquí, se muestra la arquitectura de la red U-Net utilizada que toma una imagen de entrada adquirida y genera un mapa de probabilidad basado en eventos para guiar el microscopio. La U-Net consta de secciones de codificador (capas de muestreo descendente, azul), decodificador (muestreo ascendente, verde) y conexiones entre capas (beige).

Para empujar la barrera de las imágenes volumétricas, se han desarrollado excitación multifotónica49,50,51, formación de frente de onda52, limpieza de tejidos53 y microscopía de expansión54,55 para superar las limitaciones físicas de las imágenes debido a los procesos de absorción y dispersión de la luz. La dispersión y la absorción físicas surgen debido a los cromóforos absorbentes inherentes a los tejidos, como la sangre, la melanina, el agua o los pigmentos, y los dispersores a pequeña y gran escala en la estructura de las células y los tejidos56,57. Esto da como resultado una penetración reducida de la microscopía óptica en el tejido, lo que limita la obtención de imágenes a unas pocas decenas a cientos de micrómetros desde la superficie del tejido58 (es decir, un camino libre medio óptico).

La excitación multifotónica49,50,51 ha aumentado la profundidad de penetración óptica a más de un mm en algunos tejidos49,59. Sin embargo, es importante destacar que la microscopía de hoja de luz no se beneficia tanto de la excitación multifotónica como lo hacen las técnicas de escaneo de trama. Esto se debe a que un microscopio de lámina de luz aún necesita formar una imagen de campo amplio, que está severamente limitada por la dispersión de la luz en la longitud de onda visible. Por el contrario, los microscopios de barrido ráster de múltiples fotones no necesitan formar una imagen nítida con los fotones de fluorescencia que regresan y, como tales, pueden profundizar mucho más. Por lo tanto, la microscopía de lámina de luz intravital se limita actualmente a una profundidad de menos de 100 micrones en la mayoría de los tejidos.

Como alternativa, una elección juiciosa de un organismo modelo razonablemente translúcido, como las líneas de pez cebra sin pigmentación60, ha permitido obtener imágenes de láminas de luz in situ e in vivo. Además, ajustar mejor el índice de refracción del medio de inmersión a la muestra61,62 reduce la dispersión y, por lo tanto, mejora la profundidad de penetración. Además, un cambio a sondas fluorescentes en la ventana del infrarrojo cercano II (900–1700 nm) se ha mostrado prometedor para aumentar el alcance de los microscopios de lámina de luz en los tejidos63. Las longitudes de onda más largas tienen intrínsecamente un camino libre medio de dispersión más largo y pueden superponerse con la ventana de absorción de los tejidos biológicos64. Sin embargo, el desarrollo de sondas para esta ventana óptica sigue siendo un desafío, ya que absorber y emitir en longitudes de onda más largas requiere una mayor conjugación electrónica, que a menudo se acompaña de una rigidez molecular reducida, mayores fuentes de desintegración no radiativa y bajos rendimientos cuánticos65,66. Los puntos cuánticos67 y los nanotubos de carbono68 se han utilizado como alternativa a las proteínas fluorescentes/moléculas colorantes, pero complican la especificidad y la biocompatibilidad del etiquetado. Por lo tanto, el futuro de las imágenes de láminas de luz infrarrojas cercanas depende en gran medida de los avances futuros en el desarrollo de sondas.

Además, el progreso en los esquemas de corrección de frente de onda, en particular la óptica adaptativa multiconjugada (MCAO)69,70, puede aumentar aún más la profundidad de penetración óptica. MCAO aborda el problema de que la óptica adaptativa convencional solo puede corregir un área pequeña, el llamado parche isoplanático71,72. En los tejidos, este parche puede ser más pequeño que el campo de visión de la cámara, anulando los beneficios de la detección paralela de la microscopía de lámina de luz. Mediante la corrección de diferentes regiones de tejido por separado, la MCAO tiene el potencial de aumentar el tamaño del parche isoplanático69,70 y puede permitir imágenes de láminas de luz efectivas en los tejidos. Se ha demostrado la óptica adaptativa convencional para la microscopía de hoja de luz73,74, pero la configuración presentaba una gran complejidad. Para corregir rápidamente las aberraciones que varían espacialmente, se emplearon sensores de frente de onda dedicados y espejos deformables tanto en la ruta de excitación como en la de emisión del microscopio de lámina de luz. Como tal, al principio puede parecer descabellado agregar aún más componentes para MCAO, lo que hace que dicho sistema sea demasiado complejo. Sin embargo, imaginamos que a través del aprendizaje automático, las aberraciones se pueden detectar sin sensores de frente de onda dedicados75,76, lo que alivia significativamente las limitaciones del equipo. Además, en lugar de espejos deformables, las placas de onda deformables transmisivas se han mostrado prometedoras para la corrección del frente de onda77. En principio, dichos dispositivos se pueden apilar en un espacio de imagen del microscopio para realizar MCAO, o se puede diseñar un dispositivo de modelado de frente de onda 3D integrado y dedicado.

Para los tejidos fijos, la preparación de la muestra mediante la limpieza del tejido53 puede superar en gran medida las limitaciones de profundidad asociadas con la dispersión de la luz. Particularmente interesante en este contexto es la microscopía de expansión54,55, que puede aumentar físicamente una muestra diez veces o más78,79 (Fig. 1d). Esto aumenta efectivamente el poder de resolución de cualquier microscopio por el factor de expansión y, por lo tanto, permite que los microscopios de lámina de luz alcancen niveles de resolución que hasta ahora estaban limitados a la microscopía de súper resolución (Fig. 2a). Por lo tanto, la microscopía de expansión es una forma de superar la barrera de la imagen volumétrica mediante la modificación de la muestra, con la advertencia de que el proceso de expansión no siempre conserva la ultraestructura y se necesita una validación cuidadosa80. El desafío ahora es obtener imágenes de los volúmenes mil veces más grandes de manera efectiva, lo que incluso probará los microscopios volumétricos de lámina de luz más eficientes. A medida que avanza la microscopía de expansión, vemos una mayor necesidad de diseñar nuevos microscopios de lámina de luz con un campo de visión cada vez mayor, cámaras más grandes y distancias de trabajo. Además, las técnicas que rápidamente mosaico81,82 o escanear39 la hoja de luz para cubrir un gran campo de visión podrían volverse más necesarias en esta búsqueda.

Si bien es posible superar las barreras de las imágenes con desarrollos novedosos, como lo han hecho la microscopía de hoja de luz3 y la microscopía de expansión54,55, un enfoque complementario es combinar modularmente las fortalezas de diferentes técnicas en un flujo de trabajo de imágenes (Fig. 3c). Por lo tanto, el sistema del microscopio determinará por sí mismo cuándo y cómo aplicar qué módulo, como el muestreo espaciotemporal, el campo de visión y la irradiación de la muestra. Por lo tanto, prevemos que estos esquemas de imágenes inteligentes y adaptables superarán el muestreo tradicional de Nyquist y ampliarán las capacidades de la microscopía óptica, incluida la microscopía de hoja de luz.

Ya se han dado los primeros pasos hacia tales esquemas universales inteligentes y adaptables. Un requisito emergente para cualquier esquema de imágenes inteligente y adaptativo es un circuito de retroalimentación basado en el procesamiento sobre la marcha en tiempo real de los datos adquiridos para monitorear los cambios.

Se ha establecido el análisis en tiempo real de las imágenes del microscopio para mejorar los parámetros de imagen dentro de una modalidad de imagen. En un artículo histórico, McDole et al.4 aplicaron microscopía de hoja de luz adaptativa para capturar el desarrollo de embriones de ratón (Fig. 1b) mediante el seguimiento de muestras en tiempo real y el ajuste automático del volumen general de imágenes y otros parámetros del microscopio. El esquema de imágenes compensa la deriva, el crecimiento y las propiedades ópticas cambiantes, mejorando la rutina de microscopía automatizada AutoPilot83 publicada anteriormente que requería un tamaño y una forma casi constantes. Los parámetros importantes para las técnicas basadas en láminas de luz son la optimización del volumen de imágenes y la superposición espacial entre la lámina de luz y los planos focales de detección, incluidas sus compensaciones y ángulos relativos4,83]. En nuestra opinión, la principal diferencia con un microscopio tradicional es el desacoplamiento de la iluminación y la detección y, por lo tanto, esta alineación relativa es fundamental para obtener el mejor rendimiento de imagen. Además, se han diseñado esquemas de imágenes para encontrar automáticamente los mejores ángulos en adquisiciones SPIM31 o personalizar la dosis de iluminación en microscopía de superresolución84,85 y microscopía multifotónica86,87,88. Además, el ajuste automático del volumen de imágenes para adaptarse a la morfología de la muestra mostró una reducción drástica en la duración de las imágenes y la dosis de luz general y, por lo tanto, mejoró la salud de la muestra89,90,91.

Para cambiar entre las modalidades de imagen (Fig. 3c), se requieren mecanismos para detectar eventos de interés. Por lo tanto, la detección de eventos se basa en la identificación temprana de cambios en las estructuras biológicas o el comportamiento, como una próxima división celular o señalización celular, por nombrar algunos ejemplos. En una implementación temprana de la microscopía basada en eventos, Almada et al.92 realizaron un tratamiento de muestras basado en eventos, de alto contenido y sin supervisión, e imágenes en tiempo real y fijas. Por lo tanto, se basaron en el redondeo de células mitóticas como señal biológica, determinada por la segmentación de células sobre la marcha con el umbral de Otsu. Combinando imágenes de campo amplio para la detección de eventos con imágenes de superresolución STED, Alvelid et al.93 diseñaron un método multiescala automatizado para obtener imágenes selectivas del reclutamiento de proteínas, el tráfico de vesículas y la actividad del biosensor con alta resolución. Al aplicar la detección de picos acelerada por GPU, realizaron el procesamiento de datos en una escala de tiempo de milisegundos. Además, las redes de aprendizaje profundo basadas en GPU, como la arquitectura U-Net94 (Fig. 3d), prometen un gran potencial para la detección de eventos debido a su procesamiento paralelo inherentemente rápido de imágenes grandes una vez entrenadas y al desarrollo activo de hardware especializado, como Unidades de procesamiento de tensores (TPU)95. Mahecic et al.96 aplicaron una red de este tipo para la detección de eventos de próximas divisiones mitocondriales y bacterianas, lo que permitió obtener imágenes rápidas y selectivas de estos procesos a velocidades que coincidían con su dinámica temporal.

Si bien las imágenes en vivo son actualmente el principal impulsor de tales esquemas de adquisición inteligente, también imaginamos que se vuelvan importantes en la exploración de órganos limpios e incluso animales completos. Si bien el tiempo no es una barrera difícil, después de que todas las muestras ya no están vivas, sigue siendo un factor. Esto es especialmente cierto para experimentos repetidos y particularmente en entornos clínicos donde las biopsias de tamaño mm son rutinarias y se debe lograr la resolución celular para la identificación precisa del tipo de célula para el pronóstico. La cantidad de datos generados por la obtención de imágenes de tejidos grandes y limpios tampoco puede subestimarse, especialmente en el contexto de la microscopía de expansión. Por lo tanto, los esquemas de imágenes inteligentes serán cruciales para explorar tejidos limpios y cambiar de forma autónoma a imágenes de mayor resolución solo en áreas de interés.

En el corazón de las rutinas de microscopios inteligentes y adaptativos se encuentra el software de control del microscopio que permite esquemas de control adaptativo y detecciones de eventos. En las implementaciones disponibles, se ha hecho evidente la importancia del software de control de código abierto. El software de código abierto permite controlar y modificar todos los aspectos de la adquisición e integración del microscopio con el software de análisis de imágenes rápido disponible. Estos esfuerzos están encabezados por software de código abierto como Micro-Manager97, Pycro-Manager98, AutoScanJ99 u otro software de control basado en Python100,101. Dado que el software de código abierto a menudo es desarrollado y mantenido por pocos colaboradores, seguirá siendo un desafío mantener y adaptar los scripts al nuevo hardware e incorporar nuevos algoritmos de procesamiento sobre la marcha. Por lo tanto, la modularidad del software es esencial, y la contenedorización de los flujos de trabajo de procesamiento de imágenes podría contribuir a mantener la compatibilidad, permitiendo varios entornos de software en una computadora102,103. Para los proveedores de microscopios comerciales, creemos que será fundamental proporcionar interfaces para estas herramientas de código abierto. Una forma de lograr esto podría ser habilitar eventos activados por mensajes de red en los protocolos de adquisición99.

Si bien se establecieron los fundamentos de los microscopios inteligentes y adaptables, la era de los microscopios inteligentes acaba de comenzar. Reconociendo el avance que las redes de aprendizaje profundo han logrado en otros campos, como la predicción de secuencia a estructura con AlphaFold104 y los modelos de lenguaje generativo a gran escala con GPT105, imaginamos experimentos de microscopio en los que un usuario podría ingresar palabras clave como "capturar todos los eventos de endocitosis". y el microscopio luego generaría imágenes sistemáticas de estos eventos en la muestra.

Esto requeriría entrenar redes de aprendizaje profundo con base universal en conceptos biológicos fundamentales y asociar términos biológicos con sus apariencias de microscopía visual. La creciente disponibilidad de repositorios de imágenes públicas, por ejemplo, Image Data Resource106, y la directriz reciente de los NIH de poner a disposición todos los datos de imágenes asociados con una publicación podría ser un primer paso hacia esta dirección para entrenar dichas redes. Siguen existiendo desafíos, por ejemplo, la disponibilidad de cantidades masivas de datos de microscopio con anotaciones insuficientes podría hacer que tengan menos impacto para entrenar las redes de aprendizaje profundo anticipadas para microscopía. Fundamentalmente, a diferencia del lenguaje natural, las imágenes no están vinculadas a un "diccionario" o "vocabulario" visual estándar, sino que demuestran una heterogeneidad visual significativa incluso para la misma biología. Sigue siendo una pregunta abierta cómo garantizar la generalización y la escalabilidad de cualquier red entrenada más allá de un solo proceso biológico y laboratorio. Además, la capacitación de una red de microscopía universal de este tipo probablemente incurrirá en costos significativos que actualmente están fuera del alcance de las instituciones de microscopía, y mucho menos de los laboratorios individuales. Para superar algunas de estas limitaciones, las redes de aprendizaje profundo autosupervisadas se han mostrado prometedoras en la identificación de características morfológicas similares dentro de grandes repositorios de imágenes histológicas de portaobjetos completos, independientemente del tamaño de la imagen del repositorio y casi sin anotaciones107. El desarrollo de técnicas para aprender solo de una supervisión débil o limitada108 o implementar el aprendizaje activo de expertos en el ciclo109 para anotar y refinar los casos 'difíciles' también puede presentar una vía prometedora y rentable para escalar el aprendizaje.

En una vía similar, los modelos probabilísticos 'no supervisados' podrían aprender la distribución de las imágenes disponibles para permitir la búsqueda de eventos raros para descubrir una biología previamente desconocida. Un ejemplo de un hallazgo tan raro realizado por anotadores humanos ha sido el descubrimiento de estructuras en la vasculatura cerebral del pez cebra denominada Kugeln110 después de muchos años de investigación e imágenes de la vasculatura cerebral del pez cebra. En el futuro, un microscopio inteligente podría presentar tales descubrimientos por sí mismo.

Otra limitación actual para el procesamiento sobre la marcha es el tiempo requerido para el procesamiento de datos, ya que un microscopio de lámina de luz puede generar fácilmente gigabytes de datos en segundos. Sin embargo, esperamos un progreso considerable hacia canalizaciones de procesamiento más rápidas en el futuro previsible. Además del progreso en mejores algoritmos, esta aceleración vendrá en parte por el progreso en el hardware informático. Las arquitecturas informáticas actuales todavía se basan predominantemente en memorias de CPU y GPU discretas y divididas, lo que requiere una transferencia lenta de los datos entre ellas. En el futuro, esperamos que la adquisición del microscopio se base en un solo recurso de memoria física (por ejemplo, Soc DRAM), compartido por la CPU y la GPU, actualmente, por ejemplo, disponible en NVIDIA Jetson111, lo que eliminará la copia de datos entre la CPU y la GPU y, por lo tanto, hará lo mejor de ambos mundos disponible para un procesamiento rápido, potencialmente incluso en el chip de la cámara. Por lo tanto, la microscopía puede beneficiarse del desarrollo de herramientas que permitan la conducción autónoma, donde se analiza una gran cantidad de imágenes sobre la marcha para identificar peligros en la calle, otros automóviles o peatones.

Además de cambiar los parámetros y módulos de imágenes durante la adquisición con esquemas de imágenes inteligentes y adaptativos, se pueden diseñar esquemas de adquisición en los que se reconstruye un conjunto de datos de imágenes de mayor resolución después de la adquisición de un escaneo de baja resolución o un escaneo que contiene deliberadamente regiones faltantes. Esto tiene el potencial de reducir significativamente la dosis de luz general en la muestra, el volumen de datos adquiridos y el tiempo de adquisición. Después de la reconstrucción de la imagen, la resolución del sistema de imagen original se recupera, o incluso se aumenta, superando las compensaciones tradicionales de imagen (Fig. 3a). Con el progreso en la teoría de la reconstrucción de imágenes con enfoques de detección comprimida112,113,114 y aprendizaje automático115,116,117,118, esperamos que dichos algoritmos se generalicen más en el futuro.

La detección comprimida112,113,114 es un marco matemático que describe cómo capturar y representar señales (imágenes) a tasas significativamente inferiores a la tasa de Nyquist. La teoría de la detección comprimida se basa tradicionalmente en tres conceptos: escasez, incoherencia y muestreo aleatorio119. Si se dan los tres, se puede lograr la reconstrucción exitosa de una señal submuestreada. Una señal es escasa cuando se puede representar en un determinado dominio o base con solo unos pocos parámetros distintos de cero. Por lo tanto, la restricción de escasez generalmente se cumple para la microscopía fluorescente, ya que a menudo ya son escasas en su representación de píxeles (por ejemplo, pocas estructuras etiquetadas selectivamente), o pueden comprimirse fácilmente, lo que significa que hay una base, por ejemplo, en wavelets, en que muchos componentes son cero. Sin embargo, la incoherencia (los valores en la matriz de medición se distribuyen uniformemente) y el muestreo aleatorio uniforme a menudo faltan en la microscopía119. Después de todo, los sensores de imagen actuales adquieren datos de manera determinista sobre una matriz 2D y no de forma aleatoria. No obstante, la aplicación de la detección comprimida se ha demostrado con éxito y se han introducido nuevos principios para la detección comprimida para cerrar la brecha entre la teoría y la práctica: incoherencia asintótica, escasez asintótica y muestreo multinivel119.

Se han demostrado varias aplicaciones exitosas de detección comprimida en imágenes y microscopía120. Estas aplicaciones incluyen una velocidad de fotogramas acelerada masiva de las cámaras, que alcanza los 100 000 millones de fotogramas por segundo121. Además, se implementó la detección comprimida en un microscopio de lámina de luz de celosía y un microscopio de epifluorescencia para reducir la exposición a la luz y el tiempo de adquisición de 5 a 10 veces122, y se aplicó para obtener imágenes anatómicas de alto rendimiento de cerebros completos de ratón de ~400 mm3 en una escala de tiempo de ~10 min123. Es importante destacar que la reconstrucción de detección comprimida no está supervisada y no requiere datos de entrenamiento previos. Además, la precisión de la reconstrucción mejora a medida que aumenta la resolución124. Esto hace que la detección comprimida sea una técnica atractiva para el futuro de los esquemas de imágenes de láminas de luz inteligentes de múltiples resoluciones.

Del mismo modo, las redes de aprendizaje profundo pueden aprender a restaurar imágenes a partir de datos de entrenamiento125,126,127. Por lo tanto, el aprendizaje profundo puede abordar varias limitaciones de la detección comprimida126. Tradicionalmente, la detección comprimida requiere un procedimiento de reconstrucción artesanal, que puede ser difícil de establecer para modelos de imágenes sofisticados. Además, dichos procedimientos de reconstrucción se basan en algoritmos iterativos de optimización inversa que tienden a ser lentos y delicados para ajustarse correctamente y, por lo tanto, la reconstrucción es difícil de lograr en tiempo real. Por el contrario, la reconstrucción con aprendizaje profundo requiere solo una única propagación rápida a través de la red. Además, la incoherencia (asintótica) de los datos necesarios para la detección comprimida no es estrictamente necesaria para las redes de aprendizaje profundo, por el contrario, podrían beneficiarse de datos coherentes. No es sorprendente que las aplicaciones del aprendizaje profundo para la reconstrucción de imágenes sean, por lo tanto, un área de investigación muy activa y se hayan desarrollado una variedad de redes para esta tarea126,127.

Sin embargo, el aprendizaje profundo enfrenta varios desafíos. Los modelos de aprendizaje profundo aún no brindan la generalización, la solidez y la estabilidad de las reconstrucciones proporcionadas por la detección comprimida establecida y sufren alucinaciones, es decir, la creación de artefactos que parecen realistas127,128. Esto está relacionado con la cuestión de cómo las redes bien entrenadas generalizan fuera de su conjunto de entrenamiento y modelan la equidad, la capacidad de los modelos para capturar y representar igualmente fenotipos comunes y raros. Esperamos un progreso considerable en los próximos años para abordar estas cuestiones. Por lo tanto, el informe de cuantificación de incertidumbres será crucial para interpretar las reconstrucciones. Para ello, existen modelos como la inversión bayesiana129 y técnicas como el abandono bayesiano130 para generar medidas de incertidumbre a partir de modelos de aprendizaje profundo. Sin embargo, la precisión de las medidas de incertidumbre requiere una evaluación externa adicional para determinar su capacidad para dar cuenta de la incertidumbre epistémica y aleatoria131,132.

Además, el enfoque basado en datos de las redes de aprendizaje profundo depende de la disponibilidad de buenos datos de entrenamiento (tamaño, equilibrio y calidad) que reflejen la aplicación prevista. Esto es particularmente cierto para la reconstrucción de imágenes, que requiere una salida con datos de la más alta resolución, en contraste con las tareas de clasificación y segmentaciones (binarias) que son, en esencia, datos gruesos. Sin embargo, mientras que las redes populares como GPT105 dependen de una gran cantidad de datos disponibles con restricciones limitadas, las tareas de reconstrucción de imágenes de microscopía suelen ser aplicaciones especializadas con pequeños conjuntos de datos. Una esperanza es que en el futuro, con los mandatos de alojar todos los datos microscópicos que acompañan a una publicación, eventualmente estarán disponibles muchos más y mejores datos de entrenamiento anotados. Además, el aumento de datos, por ejemplo, por transformación geométrica, como rotaciones de imágenes, puede aumentar el tamaño de los datos133. Además, la aplicación de una red de aprendizaje profundo que fue entrenada previamente para diferentes tareas en conjuntos de datos más diversos y más grandes podría ser beneficiosa, un concepto conocido como aprendizaje de transferencia134. Además, los enfoques de metaaprendizaje135,136 para entrenar redes específicamente en la configuración de pocas imágenes pueden generar redes de mayor rendimiento en una implementación real. Del mismo modo, las arquitecturas de red de aprendizaje profundo más informadas físicamente, que modelan el proceso de generación de imágenes, pueden ayudar a garantizar predicciones realistas y reducir la cantidad de parámetros libres para adaptarse a un aprendizaje más rápido y generalizable137,138. Por último, la adopción de un paradigma de aprendizaje continuo en lugar de una capacitación única puede ayudar a adaptarse continuamente a nuevos datos y condiciones de imagen.

A pesar de estas preocupaciones, las técnicas de restauración de aprendizaje profundo se han aplicado con éxito e incluso han obtenido la aprobación de la FDA para aplicaciones seleccionadas, como tomografías computarizadas139. En microscopía de súper resolución, se han informado mejoras considerables en la velocidad de adquisición a través de la restauración140,141,142. Para la microscopía de hoja de luz, las redes de aprendizaje profundo como CARE143 han mejorado la relación SNR de las imágenes adquiridas con menos potencia láser o una exposición más rápida. Curiosamente, también se han aplicado redes de aprendizaje profundo para influir directamente en el proceso de muestreo. Horstmeyer et al. desarrolló redes neuronales convolucionales para optimizar el diseño físico de un microscopio para mejorar la precisión de la identificación de células infectadas con malaria en un 5-10%144. Esperamos que los desarrollos futuros aprovechen aún más esta vía de optimización conjunta de la adquisición de imágenes con redes de aprendizaje profundo para el análisis. Comprender tanto el sistema de imágenes como el proceso conducirá a tiempos de procesamiento más rápidos y mejores reconstrucciones138.

En última instancia, también es importante darse cuenta de que una imagen suele ser un paso intermedio para la cuantificación de un proceso biológico. Por lo tanto, para muchos estudios, una imagen reconstruida de aprendizaje profundo visualmente atractiva puede ser menos importante que tener datos de imágenes con conclusiones rigurosamente cuantificables. Esto podría aliviar algunos de los desafíos descritos anteriormente, pero requiere una comprensión precisa del sistema de imágenes y la formación de imágenes. Con este fin, Pégard et al. demostrar la microscopía de campo de luz compresivo, lo que permite la cuantificación en tiempo real de la actividad cerebral sin tener que reconstruir una imagen 3D145.

Anticipamos que la propia tecnología de láminas de luz avanzará en forma de diseños ópticos refinados, mejores detectores, sondas novedosas, capacidad de formación de imágenes NIR y métodos de contraste potencialmente no fluorescentes, como la dispersión Raman. Sin embargo, algunos aspectos técnicos de la tecnología de láminas de luz pueden optimizarse al máximo, como la apertura numérica que se puede cubrir en un microscopio de lámina de luz146,147. Más ganancias en esta área probablemente también disminuirían la practicabilidad del instrumento. Esto viene impuesto por la configuración ortogonal de LSFM y el hecho de que los objetivos de alta NA necesitan un gran ángulo de apertura. Como resultado, mejorar la resolución lateral más allá de un cierto umbral tiene el costo de reducir la resolución axial y viceversa, ya que los conos de luz de excitación y detección comparten un ángulo sólido limitado.

En cambio, creemos que el impacto futuro de los sistemas de láminas de luz depende en gran medida de su practicidad y aplicabilidad a las preguntas de investigación biológica y biomédica. Muchos diseños tradicionales de láminas de luz requieren un montaje de muestra no tradicional5,36 y ofrecen solo un espacio limitado para la muestra en sí (Fig. 1a).

Una alternativa prometedora son los microscopios abiertos37,148 y de plano oblicuo (OPM)8,28,149, que dejan medio espacio libre (fig. 4a) para colocar muestras de, en principio, tamaños arbitrarios. El avance en el diseño óptico de estos microscopios ha permitido microscopios con gran campo de visión milimétrico150,151,152,153,154 y microscopios de alta resolución8,155, e incluso con ambas modalidades156. Recientemente, también se han desarrollado microscopios comerciales basados ​​en microscopía abierta157. Como tal, creemos que los sistemas OPM y de parte superior abierta permitirán una adopción generalizada de la microscopía de hoja de luz, ya que se pueden emplear métodos de montaje de muestras convencionales y, en principio, es posible la integración en cuerpos de microscopio estándar con OPM. Esto abre el camino para la obtención de imágenes tridimensionales de alto rendimiento utilizando placas de múltiples pocillos, imágenes de muestras tóxicas o infecciosas contenidas en placas (selladas) y enfoques de imágenes multimodales (Fig. 4b).

una microscopía de hoja de luz de plano oblicuo (OPM) es un ejemplo de geometrías superiores abiertas, donde un objetivo principal de NA alta proporciona iluminación (azul) y detección (tres emisores fluorescentes a lo largo de la hoja de luz, que se muestran en verde oscuro, luz el verde muestra la fluorescencia recolectada por OPM de estos tres emisores). Esto elimina la necesidad de objetivos de iluminación adicionales como en los microscopios de lámina de luz tradicionales y, por lo tanto, proporciona un nuevo espacio de diseño óptico disponible y una accesibilidad mejorada. Para escanear un volumen 3D, la hoja de luz se escanea a través del objetivo y no es necesario mover la platina ni la muestra. b OPM facilita la microscopía de hoja de luz para (i) aplicaciones novedosas de alto rendimiento, de múltiples pozos y dispositivos de microfluidos, (ii) imágenes de nuevas sondas que están selladas para reducir la contaminación durante largos períodos de tiempo e imágenes de patógenos como bacterias y virus, (iii) y combinaciones con otras modalidades como la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM).

Open top y OPM también han abierto nuevos espacios de diseño para la ingeniería óptica. OPM se basa en el reenfoque remoto158, que describe la capacidad de crear una imagen 3D sin aberraciones de la muestra en un espacio remoto lejos de la muestra. El plano de la hoja de luz inclinada dentro de esa imagen 3D se puede mapear con otro microscopio en una cámara. Si bien el principio de enfoque remoto158 subyacente al OPM se estableció hace más de una década, recientemente se volvió a analizar159 para permitir la obtención de imágenes en diferentes índices de refracción. Los nuevos hallazgos pueden permitir imágenes de hoja de luz de alta resolución en cualquier medio de inmersión, lo que aumenta la versatilidad y la aplicabilidad de la microscopía de hoja de luz. Esto debería servir solo como un ejemplo de cómo las mejoras aún podrían provenir de los descubrimientos de los principios y la teoría óptica, así como de la ingeniería.

Esperamos que la microscopía de hoja de luz desempeñe un papel importante en las ciencias biomédicas y las aplicaciones clínicas para la obtención de imágenes microscópicas y macroscópicas en el futuro. Su combinación de imágenes volumétricas rápidas pero suaves servirá como base para estudios fisiológicamente relevantes de biología celular en cultivo celular, en organoides, en tejido (diseñado), biopsias clínicas y en animales completos. Como tal, uno puede soñar en grande, un futuro donde la biología subcelular se pueda estudiar en vivo en su contexto nativo, sin las limitaciones impuestas por los métodos tradicionales de cultivo celular en cubreobjetos.

Para lograr este sueño, esperamos que los microscopios de hoja de luz superen las barreras de imágenes volumétricas y temporales impuestas por las limitaciones de los sistemas de microscopio y la muestra. Esto ya no será una tarea que un operador de microscopio humano o un analista de imágenes pueda manejar solo. En su lugar, nuevos esquemas de control de microscopios inteligentes y adaptativos explorarán muestras de manera autónoma y autónoma para obtener imágenes de procesos de interés de forma selectiva a velocidades que coincidan con su dinámica. Estos esquemas permitirán nuevos descubrimientos biológicos autónomos y estudios sistemáticos de imágenes de procesos que tienen lugar en múltiples escalas de tiempo y duración.

Además de un mayor rendimiento, estos esquemas de adquisición también prometen frenar la avalancha de datos. Los datos actuales de la hoja de luz ya pueden alcanzar escalas de petabytes y es probable que pronto alcancen órdenes de magnitud aún mayores. Dado que los esquemas de adquisición de datos inteligentes y adaptativos ya no siguen el muestreo de Nyquist en el nivel más fino en la totalidad del conjunto de datos, el muestreo más fino solo se aplicará de forma selectiva. Además, la selección algorítmica de regiones de interés eliminará el sesgo humano y, por lo tanto, mejorará la reproducibilidad de los estudios de imágenes.

Al igual que con cualquier mirada hacia el futuro, es probable que el campo tome direcciones muy diferentes. Después de todo, ¿quién hubiera previsto la microscopía de expansión54,55 antes de 2015, que ha tenido un impacto inimaginable en la microscopía de fluorescencia? Por lo tanto, aunque estamos entusiasmados con las posibilidades que hemos descrito aquí, también esperamos que la comunidad de microscopios siga siendo tan imaginativa como lo ha sido durante los últimos 20 años, con muchas más sorpresas guardadas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

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Agradecemos a los Institutos Nacionales de Salud (subvención n.º R35GM133522) por su apoyo. Los autores agradecen a la Dra. Anna Bajur, el Dr. Kevin Dean y el Dr. Felix Zhou por sus comentarios y opiniones sobre el manuscrito.

Lyda Hill Departamento de Bioinformática, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX, EE. UU.

Stephan Daetwyler y Reto Paul Fiolka

Departamento de Biología Celular, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX, EE. UU.

Stephan Daetwyler y Reto Paul Fiolka

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SD y RF conceptualizado y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Reto Paul Fiolka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Manuel Breuer.

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Daetwyler, S., Fiolka, RP Hojas de luz y microscopía inteligente, se avecina un futuro emocionante. Commun Biol 6, 502 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04857-4

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Recibido: 04 febrero 2023

Aceptado: 20 de abril de 2023

Publicado: 09 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04857-4

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